实验原理

细胞迁移是多细胞生物发育和存活关键的生物学过程，是细胞运动的表型之一。胚胎发育时器官的形成、伤口的愈合、免疫应答等都需要细胞非常精准的迁移到特定部位，就连威胁人体健康的癌症转移也少不了细胞迁移。

细胞划痕是通过在细胞单层上划痕并通过延时显微镜定期捕获图像，从而研究细胞迁移运动、修复能力和细胞间相互作用的实验室技术。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，在一定程度上面模拟了体内细胞迁移过程。于细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过测量不同时间点的划痕间距并计算差值，可对细胞的迁移能力做出判断。

操作步骤

1. 消化细胞

镜下观察细胞状态，吸掉培养细胞的旧培养基。PBS缓冲液洗去残留的旧培养基,加入胰酶，晃动混匀，使胰酶充分接触细胞；

2. 终止消化

当镜下观察有80%-90%的细胞变得圆形透亮时终止消化，即加入2倍胰酶体积的完全培养液终止消化，充分吹打细胞，使细胞能够完全脱落；

3. 划线+铺板

先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。将细胞悬液接种于6孔板中，铺板的细胞数量以过夜后细胞融合率达到100%为原则；

4. 划痕

第二天用1ml枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜，划线要快，力度均一。弃去培养液，用PBS冲洗两遍，除去划下的细胞，加入无血清培养基或低于2%血清的培养基；

5. 拍照

擦去6孔板背后的marker横线划痕。4倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，加入待测样本，设置浓度梯度，可按0、6、12、24h时间点取样，拍照；

6. 结果分析

使用Image J软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值或者划痕面积均值；

7. 数据处理

细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始划痕面积-t时刻划痕面积)/初始划痕面积

细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始细胞间距离均值-t时刻细胞间距离均值)/初始细胞间距离均值

注意事项

1. 划线的目的只是为了辅助划痕时划的更直，有利于后续拍照分析，划线会在拍照前擦去。

2. 细胞接种数量需根据细胞生长速度和状态而定，接种原则为过夜后融合率达到100%，即细胞间没有空隙，否则会影响后续拍照分析。

3. 同浓度不同孔之间划痕最好使用同一只枪头，减少划痕距离的误差。划痕时枪头垂直，不能倾斜，可比着直尺或孔板盖，保持力度一致，一次性划完。

4. 冲洗时要温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞，反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片。

5. 降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法：①使用无血清或低血清培养基（<2%）可降低细胞增殖对实验结果的影响；②一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6，12，24h)检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间；③如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素(1µg/ml)处理1h，抑制细胞的分裂。

6. 尽量保证各个划痕宽度一致。

7. 并非所有细胞都适合划痕实验，以乳腺癌为例，乳腺癌细胞MCF-7几乎很难迁移，而MDA-MB-231具有很强迁移性。所以，细胞的选择需要考虑细胞自身的迁移能力，一般需要迁移强的细胞，而且对无血清的环境有较强的忍受力（至少24h）。然而很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12h细胞凋亡就超过50%，因此细胞划痕法对部分肿瘤细胞并不适用。