CRISPR可能是当今最重要的基因编辑产物，它有望颠覆自然基因组、消除遗传疾病。但是“准确性”一直都是我们面临的阻碍。

　　早在2017年，一份使用CRISPR的被告就引起了争议。在该实验的老鼠身上发现了大量脱靶基因现象，导致相关酶肆意剪切与疾病不相关的基因。尽管这项研究遭到了激烈的驳斥，并最终被撤回，但人们对这种强大工具的脱靶突变仍深感担忧。

　　即使是基于CRISPR的编辑器(可以有选择性、相对准确地剪切基因序列)，最近也受到抨击，因为它在DNA和RNA中引起了数百个不定向突变。

　　如果不能确保高水平的准确性，提出的任何CRISPR基因治疗都将成为一场基因骗局。

　　现在，杜克大学的一个团队可能已经发现了一个通用的解决方案，可以从根本上提高各种 CRISPR的准确性。本月发表在《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上的这项研究，对指导RNA的结构进行了修饰。指导RNA是CRISPR中不可或缺的靶向“侦查猎犬”，它能在Cas酶剪切前捕捉特定的DNA序列。

　　这种修饰看似非常简单：将一个“锁定”结构标记到指导RNA的一端，这样只有目标DNA才能被Cas酶所剪切。正是因为这个修饰非常简单，指导RNA 2.0才可以从根本上将多个CRISPR系统的准确性提高将近200倍——不仅可以改进那些依赖于经典Cas9的系统，还包括利用Cas12a和其他剪切酶的较新的诊断系统。

　　这一方案与以往提高CRISPR准确性的方法截然不同。以往的方法属于增量调整，通常包括寻找新的、更好的Cas剪刀酶。

　　“我们关注的是一种新的解决方案，它不需要去寻找新的分子，并且适用于任何一种CRISPR系统。”研究报告的作者Dewran Kocak说。

　　首席作者Charles Gersbach博士补充说道：“这是一个能有效消除脱靶效应的解决方案。”

　　1.Hello，我是指导RNA!

　　为什么改变“侦探猎犬”指导RNA的分子结构可以从根本上提高CRISPR的准确性?

　　历史已经见证了RNA结构的重要性：例如，获得诺贝尔奖的基因沉默技术RNAi花了数十年时间才揭示，对靶向RNA的微小调整可以大大降低免疫反应，或提高效率和准确性。

　　RNAi的发现来之不易，而从中汲取的经验教训可以用来指导改进基因编辑。我们通常这样描述CRISPR过程：指导RNA——一个看起来像正在蠕动的蠕虫分子——包含一个与目标DNA相匹配的碱基序列。

　　指导RNA和目标DNA结合时，需遵循严格的碱基配对原则(A与T*，C与G)，而后指导RNA将Cas酶拖动到该靶点，使之在特定的位置干净利落地剪切目标DNA分子。(*更准确地说，是“T”在DNA中，“U”在RNA中。同样的碱基，不同的名字。)

　　然而，在生物学中，理论常常与现实不符。事实上，指导RNA看起来就像多片三叶草叶子串在一起，里面都是被称为“茎环”的凸起。这使得它的结构稳定，结合效率最大化。

　　总的来说，人体中含有将近60亿个DNA碱基，而大多数指导RNA只包含20个左右的碱基，这就使得指导RNA和目标DNA错配的几率相当高。

　　由此可见，设计指导RNA既是一门科学也是一门艺术。与尤达的著名格言“做或不做，没有尝试”不同，科学家们必须经常反复修改特定的指导RNA序列，以使其正常工作。

　　不过，CRISPR始终有一个设计原型来作为修饰指导RNA分子结构的参照。杜克大学团队所要做的就是根据这样一个原型来设计出合适的指导RNA分子的结构。

　　2.一切都始于能量

　　杜克大学团队在细胞能量学中受到了启发。

　　像任何其他生物反应一样，指导RNA与DNA的结合以及Cas的释放都需要能量。之前的研究发现，指导RNA与DNA匹配的越精确，两个人就越容易形成所谓的“R环”：一种启动整个剪切过程的分子杂交体。

　　该团队的绝妙想法是在指导RNA的尾部添加一个额外的三叶草状结构。这种“发夹结构”在很多情况下就像一个物理障碍：除非RNA与目标DNA匹配，否则它庞大的结构就会阻止RNA与DNA配对形成R-环。不形成R环，酶就不会切割，这样就能保证靶外DNA序列的完整和安全。

　　如果序列匹配，指导RNA在与相应DNA配对形成R-环时，就会打开发夹，反过来刺激Cas酶进行剪切。

　　该团队在利用计算机模拟实验时，设计了一系列的发夹结构指导RNA(或可以称之为“hp-sgRNAs”)，在人类细胞中进行试验。

　　当与经典的Cas9配对时，新的指导RNA分子的目标特异性增加了约50倍。在一项观察细胞基因组中脱靶效应的敏感实验中，研究小组发现，与经典的指导RNA相比，他们的新型分子消除了124个脱靶位点，并且没有产生任何新的脱靶位点。

　　许多酶系在结构和功能上与Cas9仅有微弱的相似之处，而新型分子与这些非经典酶结合也可以产生惊人的效果。当与新的发夹结构RNA结合时，Cas12及其变体能够切割指定的DNA序列，其效率与正常导向RNA类似，但脱靶率大大降低。

　　此外，研究小组还发现，他们能够通过改变“发夹”的细微结构来微调Cas酶的强度。一个“更紧”的发夹结构使二者结合更牢固，这降低了编辑效率，但也大大提高了准确性。“松散”的发夹有助于保持Cas的活性，但准确性没有那么高。

　　研究人员解释说：“通过观察R-环的形成，我们能够预测发夹结构指导RNA的效果。”这种可预测性是宝贵的——它使未来的科学家更容易仔细校准发夹结构指导RNA和CRISPR系统的强度和准确性。

　　3.创新性修饰

　　这并不是科学家们第一次尝试提高CRISPR的准确性。

　　之前的一个想法是使CRISPR系统成为一个三角关系：一个指导RNA加上两个Cas酶。要进行DNA切割，两个Cas必须结合到相同的DNA序列。这是一个很聪明的方法，但是它需要科学家增加细胞中的物质，使本就很敏感的机体变得更加复杂。

　　另一个想法是降低Cas酶的活性，使他们不太可能脱靶。但是这种方法也有它的缺点。修饰蛋白质使其具有一定的特性是极其耗时费力的，科学家必须根据他们的需要“定制”每个Cas变体。

　　Gersbach解释说：“每次我们发现一种新的CRISPR蛋白，都要进行大规模的再次加工，使其更加精确，这并不是一个简单的事情。”

　　相比之下，杜克大学研究小组对指导RNA的发现，可能会从根本上改变未来CRISPR系统的设计。

　　Kocak说：“所有CRISPR系统都有指导RNA，这些小RNA更容易修饰。”

　　接下来，研究小组想进一步确认他们所改进的发夹结构指导RNA可以与其他有活性的Cas酶协同工作。他们还想深入研究这种合作关系是如何运作的，并尝试找到进一步提高靶向性的方法——这种研究不仅是在离体细胞中，更重要的是，要应用于有遗传疾病的动物模型中。