摘要:［目的］基于GEO数据库中乳腺癌相关基因表达谱芯片，探讨乳腺癌组织及正常乳腺组织基因表达差异。［方法］收集2016年10月—2017年10月于医院进行乳腺癌根治术患者乳腺癌组织及其对应正常乳腺组织，共213对样本。GEO数据库提取乳腺癌相关基因表达谱芯片数据，根据筛选基因对应基因差异倍数(FC)对数值，定义表达上调和下调基因。检测关键基因mＲNA表达水平，分析其水平对患者总生存期的影响。［结果］共347个基因在乳腺癌组织出现差异表达，其中包括表达上调基因207个，表达下调基因140个;乳腺癌组织与正常乳腺组织差异表达基因差异倍数前10位基因依次为KＲT19、CENPE、FOXM1、CD9、BUB1B、CDC20、NDC80、CENPE、NUSAP1、GATA3;KＲT19、CENPE、FOXM1高表达的乳腺癌患者总生存期显著差于低表达者(P＜0．05)。［结论］基于GEO数据库中乳腺癌相关基因表达谱芯片，乳腺癌组织及正常乳腺组织存在差异表达基因，且KＲT19、CENPE、FOXM1过表达为乳腺癌患者不利的预后因素，有可能成为乳腺癌基因治疗新靶点。

关键词:乳腺癌;基因芯片;差异表达基因;预后

统计数据显示，中国女性乳腺癌发病率处于较高水平，且为居民常见恶性肿瘤之一，并有年轻化趋势［1］。目前，手术、化疗、靶向治疗等手段在乳腺癌治疗运用中日趋成熟。但研究发现，乳腺癌患者复发及死亡仍未得到有效控制［2］。乳腺癌发生与发展为多因素、多基因相互作用结果［3］。基因芯片具有操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低等优点。已有研究表明，基因芯片数据分析可为癌症诊断、治疗及预后判断提供依据［4］。本研究基于GEO数据库中乳腺癌相关基因表达谱芯片，旨在探讨乳腺癌组织及正常乳腺组织基因表达差异，以及不同生存期患者关键基因表达差异。

1材料与方法

1．1组织标本收集及保存收集2016年10月—2017年10月于医院进行乳腺癌根治术患者乳腺癌组织及其对应正常乳腺组织(距癌组织＞3cm)，共213对样本;生理盐水清洗后，置于液氮中速冻，转至－80℃冰箱保存。乳腺癌患者纳入标准:①18～80岁且为女性;②经术后病理检查证实为乳腺浸润性导管癌［5］;③术前未接受放疗、化疗;④排除标准:(1)既往恶性肿瘤史或合并其他系统肿瘤;(2)随访资料缺失或不完整。研究经医院伦理委员会批准。1．2乳腺癌相关基因表达谱芯片数据提取GEO数据库(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/gds/)搜索亚洲人乳腺癌相关基因表达谱芯片数据，芯片平台为GPL570，符合本研究需要及要求的数据集登录号分别GSE50428、GSE42568、GSE15852、GSE45255。其中GSE50428包括17对样本;GSE42568包括67对样本;GSE15852包括57对样本;GSE45255包括72对样本。1．3差异表达基因将样本分为正常组和乳腺癌组，GEO分析工具中Ｒ的两个包筛选差异表达基因，计算调整后P值，以P＜0．05筛选差异表达基因，根据筛选基因对应基因差异倍数(Foldchange，FC)的对数值，将Log-FC＞2定义为表达上调基因，LogFC＜－2定义为表达下调基因。1．4组织标本关键基因mＲNA表达水平采用ＲT－PCＲ法。提取组织总ＲNA，按照总ＲNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号Ｒ1200)说明书操作;后按照OneStepSuperＲT－PCＲMixKit(北京索莱宝科技有限公司，货号T2240)说明书操作，逆转录合成cDNA第一链;按照2×SYBＲGreenPCＲMastermix(北京索莱宝科技有限公司，货号SＲ1110)说明书操作，荧光定量PCＲ仪上进行PCＲ反应，GAPDH为内参基因;采用2－△△Ct法计算关键基因相对表达量。1．5预后随访术后即进行随访，时间截止至死亡或者至2020年10月。分析关键基因mＲNA表达水平对患者总生存期的影响。1．6统计学处理数据利用SPSS20．0软件分析。关键基因表达采用Wilcoxon符号秩和检验分析;关键基因水平与乳腺癌患者预后相关性采用Kaplan－Meier曲线分析。P＜0．05为差异具有统计学意义。

2结果与分析

2．1乳腺癌组织与正常乳腺组织差异表达基因采用GEO2Ｒ软件筛选乳腺癌组织和正常乳腺组织差异表达基因，结果显示共347个基因在乳腺癌组织出现差异表达，其中包括表达上调基因207个，表达下调基因140个，见图1。2．2差异表达基因筛选筛选乳腺癌组织与正常乳腺组织差异表达基因FC值前10位基因(KＲT19、CENPE、FOXM1、CD9、BUB1B、CDC20、NDC80、CENPE、NUSAP1、GATA3)进行进一步研究，见表1.2．3关键基因水平与乳腺癌患者预后相关性KＲT19、CENPE、FOXM1高表达的乳腺癌患者总生存期显著差于低表达者(P＜0．05)，见图2。

3讨论

女性乳腺癌发病率和死亡率均高［6］。浸润性乳腺癌为乳腺癌常见病理类型，其中乳腺浸润性导管癌占浸润性乳腺癌40%～70%，恶性程度较高、发展速度较快［7］。手术为乳腺癌患者主要治疗方法［8］。研究表明，乳腺浸润性导管癌患者术后局部复发率较高，预后相对不良［9］。肿瘤亚型诊断对临床治疗及预后具有重要意义。人类癌症基因组测序结果表明，乳腺癌细胞之间存在高度遗传异质性，使肿瘤细胞在生长速度、侵袭能力、药物敏感性以及预后等方面产生差异［10］。基因表达谱是构建于某一特定状态下，细胞或组织非偏性cDNA文库。孙娜等［11］研究发现，胰腺癌组织和癌旁组织基因表达谱有明显不同，其中某些关键基因表达水平对胰腺癌发生具有一定预测能力。表明基因表达谱的筛选对癌症发病机制研究等可能具有重要价值。GEO数据库是全球最大基因芯片数据库之一，存储的基因组数据主要以基因芯片表达数据为主.许扬梅等［12］研究发现，直肠癌循环肿瘤细胞与原发肿瘤组织基因相比，具有特有的基因表达谱，为肿瘤复发和转移重要基础。张晶晶等［13］通过研究发现，基于GEO数据库筛选他莫昔芬耐药乳腺癌细胞基因表达谱有利于筛选乳腺癌他莫昔芬耐药生物标志物以及治疗新靶点。本研究搜索乳腺癌亚洲人相关基因表达谱芯片，采用GEO2Ｒ软件筛选乳腺癌组织和正常乳腺组织差异表达基因，共筛选出347个差异表达基因，其中包括表达上调基因207个，表达下调基因140个，基本符合以往研究结果［14］，表明基因差异表达可能参与乳腺癌发生、发展。根据Log-FC值筛选乳腺癌组织与正常乳腺组织差异表达基因FC值前10位基因发现，乳腺癌组织中KＲT19、CENPE、FOXM1、CD9、BUB1B、CDC20、NDC80、CENPE、NUSAP1、GATA3表达显著高于正常乳腺组织，有可能成为预测和判断乳腺癌发生标志物。KＲT19基因位于17号染色体，主要编码角蛋白家族成员。既往多项研究证实，角蛋白可在乳腺癌组织中表达，且其从完整到部分甚至完全缺失特征可作为浸润性癌及导管原位癌鉴别关键［15］。YAOH等［16］研究发现，KＲT19过表达与胰腺导管腺癌癌变、进展和预后不良有关。CENPE蛋白为特异性作用于细胞有丝分裂驱动蛋白。研究表明，CENPE基因缺失可显著降低肿瘤生长［17］。HAOX等［18］研究发现，CENPE在非小细胞肺癌组织高表达，并与总存活率相关。FOXM1为Fox基因家族成员，是细胞增殖相关转录因子。研究发现，下调FOXM1基因表达，可显著抑制乳腺癌BT474细胞增殖、迁移及侵袭［19］。SYＲINEAbdeljaoued等［20］研究发现，FOXM1过度表达是乳腺癌患者总生存率独立预后因素。本研究结果显示，KＲT19、CENPE、FOXM1高表达的乳腺癌患者总生存期显著差于低表达者，符合以往研究结果，提示KＲT19、CENPE、FOXM1基因有可能成为乳腺癌患者预后标志物，并成为乳腺癌基因治疗新靶点。

4结论

基于GEO数据库中乳腺癌相关基因表达谱芯片，乳腺癌组织及正常乳腺组织存在差异表达基因，且KＲT19、CENPE、FOXM1过表达为乳腺癌患者不利的预后因素，有可能成为乳腺癌基因治疗新靶点。

作者：马建萍 宋连川 单位：青海省第五人民医院

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