摘要:目的探讨阿帕替尼联合曲妥珠单抗对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法复苏胃癌BGC－823细胞并经处理后接种于96孔板中，根据加入的药物不同分为阿帕替尼(1μmol/L)组，曲妥珠单抗(0．1、1、10μg/ml)组，阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(0．1、1、10μg/ml)组，同时设置空白对照组。采用CCK－8法检测各组胃癌细胞增殖抑制情况，流式细胞术检测空白对照组和各给药组细胞凋亡情况，Westernblot检测Her－2、Bcl－2、Bax蛋白表达。结果细胞增殖抑制率在各组间比较差异均有统计学意义(均P＜0．01)。各药物治疗组细胞凋亡率均明显高于空白对照组的(2．84±0．97)%，联合治疗组明显高于单药治疗组，随着给药剂量的增加细胞凋亡率明显提升，差异均有统计学意义(均P＜0．05)。阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(10μg/ml)组细胞Her－2、Bcl－2蛋白表达水平明显低于单药组，Bax蛋白表达水平明显高于单药组，差异均有统计学意义(均P＜0．01)。结论阿帕替尼联合曲妥珠单抗可通过下调Her－2和Bcl－2蛋白表达、上调Bax蛋白表达来抑制胃癌细胞增殖，同时促进细胞凋亡。

关键词:胃癌细胞;阿帕替尼;曲妥珠单抗;增殖;凋亡

血管内皮生长因子家族及受体是促肿瘤血管生成的重要蛋白，其表达水平增加与肿瘤细胞中人表皮生长因子受体－2(Her－2)过表达明显相关;同时在Her－2阳性的肿瘤细胞中血管内皮生长因子受体2多呈高表达［1］。曲妥珠单抗是抗Her－2的单克隆抗体，能够通过阻止人表皮生长因子与Her－2的结合而发挥抑制肿瘤细胞生长作用［2］。阿帕替尼是近年来发现的新型酪氨酸激酶抑制剂，能特异性作用于血管内皮生长因子受体2，抑制肿瘤新生血管生成，还能够逆转P糖蛋白介导的肿瘤耐药性［3］。我国2014年批准阿帕替尼作为晚期胃癌治疗用药，临床实践中发现阿帕替尼对血管内皮生长因子受体2的作用效应可能优于其他抗血管生成药物。本研究通过体外细胞学实验，探讨阿帕替尼联合曲妥珠单抗对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及可能机制。

1材料与方法

1．1材料胃癌BGC－823细胞购于南京科佰生物科技有限公司;阿帕替尼购于恒瑞医药有限公司，曲妥珠单抗购于上海罗氏制药有限公司;胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养基购于北京清大天一科技有限公司;CCK－8试剂盒、双染细胞凋亡检测试剂盒购于北京沃比森科技有限公司;鼠抗人Her－2、B淋巴细胞瘤－2(Bcl－2)、Bax单克隆抗体购于上海索宝生物科技有限公司。1．2方法1．2．1细胞培养与分组复苏胃癌BGC－823细胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃5%CO2的培养箱中培养至对数生长期，使用0．25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度为1×105个/ml，接种于96孔板培养24h，弃去培养基，加入含不同药物的培养基，分为阿帕替尼(1μmol/L)组，曲妥珠单抗(0．1、1、10μg/ml)组，阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(0．1、1、10μg/ml)组，同时设置空白对照组，每组4个复孔。1．2．2细胞增殖和凋亡检测各组细胞继续培养48h，采用CCK－8法测定细胞增殖情况，计算增殖抑制率(%)=给药组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。各组细胞培养48h后收集上清液中的非贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化并收集贴壁细胞，将非贴壁细胞与贴壁细胞混合后离心，使用AnnexinV－FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测各组细胞凋亡情况。1．2．3Westernblot检测取培养48h的空白对照组、阿帕替尼(1μmol/L)组、曲妥珠单抗(10μg/ml)组、阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(10μg/ml)组细胞;ＲIPA裂解液提取蛋白并定量，行SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳，转模至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭1h，滴加鼠抗人Her－2、Bcl－2、Bax单克隆抗体(均1∶300稀释)，4℃过夜，次日滴加HＲP标记的二抗(1∶1000稀释)，室温静置2h，采集图像并分析各条带灰度值。1．3统计学分析使用SPSS24．0统计学软件包进行数据分析，本实验数据以x±s表示并进行方差分析或t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1各组细胞增殖抑制水平比较见表1。细胞增殖抑制率在各组间比较差异均有统计学意义(均P＜0．01);其中曲妥珠单抗对细胞增殖抑制作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性，随着浓度的增加抑制率逐渐提升;联合组细胞增殖抑制率明显高于单药组，随着阿帕替尼联合的曲妥珠单抗浓度增加抑制率逐渐提升。2．2各组细胞凋亡情况比较药物作用细胞48h后，空白对照组细胞凋亡率为(2．84±0．97)%，阿帕替尼(1μmol/L)组、曲妥珠单抗(0．1μg/ml)组、阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(0．1μg/ml)组、阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(1μg/ml)组、阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(10μg/ml)组细胞凋亡率分别为(2．84±0．97)、(6．16±1．72)、(9．02±1．88)、(12．38±1．76)、(21．60±3．19)%、(27．95±3．52)、(32．13±3．37)%。细胞凋亡率在各组间比较差异均有统计学意义(均P＜0．05)，其中各药物治疗组细胞凋亡率均明显高于空白对照组，联合治疗组明显高于单药治疗组，随着给药剂量增加细胞凋亡率明显提升。2．3各组细胞Her－2、Bcl－2、Bax蛋白表达水平比较见表2。Her－2、Bcl－2、Bax蛋白表达水平在各组间比较差异均有统计学意义(均P＜0．01)。阿帕替尼(1μmol/L)组、曲妥珠单抗(10μg/ml)组、阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(10μg/ml)组细胞Her－2、Bcl－2蛋白表达水平明显低于空白对照组，Bax蛋白表达水平明显高于空白对照组，阿帕替尼(1μmol/L)+曲妥珠单抗(10μg/ml)组细胞Her－2、Bcl－2蛋白表达水平明显低于单药组，Bax蛋白表达水平明显高于单药组，上述差异均有统计学意义(均P＜0．05)。

3讨论

胃癌发病率占全部恶性肿瘤的第5位，死亡率占第3位［4］。2015年我国新发胃癌67．9万例，死亡49．8万例;多数新发患者确诊时已处于晚期，无法行手术治疗，只能采取化疗、靶向治疗等保守治疗，平均生存期＜6个月［5］。新生血管形成是恶性肿瘤的主要病理特征，能够为肿瘤生长提供大量养分，促进肿瘤细胞增殖和转移［6］。曲妥珠单抗是一个靶向作用于Her－2的单克隆抗体药物。阿帕替尼是口服血管生成抑制剂，可通过竞争性结合血管内皮生长因子受体2来抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。本研究显示，阿帕替尼与曲妥珠单抗联合作用于胃癌细胞后，对细胞增殖的抑制作用和凋亡的促进作用明显优于单药治疗，提示阿帕替尼与曲妥珠单抗具有协同抗肿瘤作用。其可能原因为，单独应用曲妥珠单抗靶向抑制Her－2可能不足以控制血管生长因子介导的血管生成，还可能导致血管生成替代途径激活;而联合阿帕替尼后能够有效提升其对血管生成的抑制作用，促进胃癌细胞凋亡。本研究进一步研究显示，两种药物联合作用细胞48h后，Her－2、Bcl－2蛋白表达水平明显低于单药组，Bax蛋白表达水平明显高于单药组;提示阿帕替尼与曲妥珠单抗联合可有效下调胃癌细胞生长调控基因Her－2和抗凋亡基因Bcl－的表达，上调促凋亡基因Bax的表达，进而抑制胃癌细胞增殖并促进细胞凋亡。综上，今后研究中可进一步探讨阿帕替尼与曲妥珠单抗联合对血管内皮生长因子受体2磷酸化和下游信号通路的影响，完善联合抗胃癌细胞的机制探讨。

作者：苗方 单位：菏泽医学专科学校药学教研室

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