摘要：目的探讨肌动蛋白调节剂（Ｅｎａｂｌｅｄｈｏｍｏｌｏｇ，ＥＮＡＨ）在胰腺癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ，ＰＣ）的表达及其对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响机制。方法实时荧光定量聚合酶链式反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、蛋白免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）分别检测ＥＮＡＨ在胰腺癌细胞株的表达量及信号通路蛋白验证。小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）转染的ＳＷ１９９０、ＣＦ－ＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１作为实验组，以转染阴性对照（ＮＣ）的ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１作为对照组，荧光定量聚合酶链式反应检测转染效率。平板克隆实验检测ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１的增殖能力；流式细胞术检测ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１的凋亡率分布。结果３株胰腺癌细胞中的表达量（３．９２±０．８２；４．２８±０．３６；４．０８±０．５６）较正常胰腺导管上皮细胞株的表达量（１．２６±０．３６）明显增高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；平板克隆实验中实验组ＳＷ１９９０细胞株集落形成数量较阴性对照组（１８５．３０±９．４５、７６．３３±７．３１、９７．００±７．２１）显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＣＦＰＡＣ－１细胞株集落形成数量较阴性对照组（１６０．４４±８．２３、８７．３６±８．２８、７１．１５±６．１２）显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＰＡＮＣ－１细胞株集落形成数量较阴性对照组（１７３．２０±６．２１、５０．３７±６．８７、３２．８８±３．３４）显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。实验组ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１细胞凋亡率较阴性对照组［（１４．５２±２．９２）％、（１２．４６±２．５２）％、（４．１２±０．９２）％］，［（１３．５９±２．０２）％、（１４．３２±１．９８）％、（４．５３±０．２８）％］，［（１７．５４±３．１２）％、（１６．９３±２．５４）％、（３．９２±０．１７）％］明显增高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。结论ＥＮＡＨ在胰腺癌组织及细胞中高表达，降低ＥＮＡＨ表达后可抑制胰腺癌细胞的增殖，促进胰腺癌细胞凋亡。

关键词：肌动蛋白调节剂；胰腺癌；增殖；凋亡；信号通路

胰腺癌是一种发病率和死亡率较高且预后较差的恶性肿瘤［１］，预计在未来几年内将成为癌症相关死亡的主要原因［２］，放射治疗和手术被认为是早期和局部晚期的标准治疗方法［３］，但由于其起病隐匿的特点，往往仅有２０％的患者可行手术治疗［４］。ＥＮＡＨ是ＶＡＰＳ蛋白家族成员之一，参与细胞粘附和运动所需的肌动蛋白丝组装。最近的研究表明，ＥＮＡＨ在胃癌、肝癌、乳腺癌黑色素瘤等多种癌症中过表达，并且ＥＮＡＨ与肿瘤分级及血管浸润性相关［５］。ＥＮＡＨ在胰腺癌中的表达尚不清楚，本研究旨在探讨ＥＮＡＨ对胰腺癌细胞的影响，并就其调控机制进行进一步的研究。

１材料与方法

１材料人正常胰腺导管上皮细胞（ＨＰＤＥ６ｃ７）、胰腺癌细胞（ＳＷｌ９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１）均购自中国科学院上海细胞库。ＤＭＥＭ培养基、ＭＥＭ培养基、胎牛血清均购自于以色列ＢＩ公司；ｑＲＴ－ＰＣＲ试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司；细胞凋亡试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）购自锐博生物科技有限公司；引物由擎科生物有限公司设计合成。ＥＮＡＨ、ＧＡＰＤＨ一抗购自于Ａｂｃａｍ抗体公司；ＢＣＡ蛋白浓度试剂盒购自于索莱宝生物科技有限公司。１．２细胞培养及转染ＨＰＤＥ６ｃ７、ＳＷｌ９９０、ＣＦ－ＰＡＣ－１胰腺癌细胞株用含有１２％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基培养，ＰＡＮＣ－１用含有１０％胎牛血清的ＭＥＭ培养基培养，细胞均置于条件为３７℃、含５％ＣＯ２的恒温培养箱中培养。细胞生长密度为３０％－５０％时，按转染试剂盒说明进行细胞转染。ｓｉＲＮＡ转染的ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１作为实验组，以转染阴性对照（ＮＣ）的ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１作为对照组，培养２４ｈ后进行后续实验。１．３ｑＲＴ－ＰＣＲＴｒｉｚｏｌ试剂提取细胞总ＲＮＡ，使用逆转录试剂盒将总ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ。ｑＰＣＲ反应条件为：９５℃３０ｓ，９５℃５Ｓ、６０℃３４Ｓ，４０个循环，将表达量相对于ＧＡＰＤＨ表达标准化，２－ΔΔＣＴ法计算ＥＮＡＨ的相对表达量。ＥＮＡＨ引物序列：Ｆ：５’－ＴＴＧＧＴＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＴＴＴＧＡ－３’，Ｒ：５’－ＴＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＣ－３’；ＧＡＰ－ＤＨ序列：Ｆ：５’－ＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＡＡＧＡＣ－３’，Ｒ：５’－ＡＡＧＴＧＴＡＡＣＧＣＡＡＣＴＡ－３’。１．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ使用ＲＩＰＡ裂解液裂解细胞，从细胞中提取总蛋白质。ＢＣＡ方法测定蛋白质浓度。蛋白质样品通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳９０ｍｉｎ，后转移到ＰＶＤＦ膜上。将膜用１０％脱脂牛奶封闭３０ｍｉｎ，ＴＢＳＴ清洗，孵一抗过夜，第二天孵二抗２ｈ后ＴＢＳＴ清洗，使用ＥＣＬ发光液测量蛋白质表达。１．５平板克隆实验取转染后的胰腺癌细胞以１×１０３／孔的密度接种于６孔板中，置于条件为３７℃、含５％ＣＯ２的恒温培养箱中培养，定期检测培养基ＰＨ值，及时更换培养基。１０－１４天以后ＰＢＳ缓冲液清洗细胞，４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ，结晶紫染色３０ｍｉｎ后，置于无影灯下观察实验组与对照组细胞集落形成结果并拍照。１．６流式细胞术取转染后的胰腺癌细胞以１×１０５／ｍｌ的密度接种于六孔板中，置于条件为３７℃、含５％ＣＯ２的恒温培养箱中培养２４ｈ，按细胞凋亡检测试剂盒说明加入转染后的实验组与对照组胰腺癌细胞中，流式细胞仪检测ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１细胞的凋亡率。１．７统计学方法应用ＳＰＳＳ２２．０统计软件分析，计量资料结果均以均值±标准差（Ｍｅａｎ±ＳＤ）表示，ｔ检验确定各组间的差异是否显著。各项实验重复三次，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２结果

２．１ＥＮＡＨ在胰腺癌细胞株中高表达ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１三株胰腺癌细胞中的表达量（３．９２±０．８２；４．２８±０．３６；４．０８±０．５６）较人正常胰腺导管上皮细胞株的表达量（１．２６±０．３６）明显增高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）（图１）。图１ＥＮＡＨ２．２平板克隆实验检测ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１三株胰腺癌细胞在培养１４天以后集落形成数量实验组均明显低于各自对照组，差异有统计学意义，Ｐ值均＜０．０５（见表１）。集落形成实验证明降低ＥＮＡＨ表达抑制了ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１的细胞增殖能力。２．３流式细胞术凋亡检测转染后的胰腺癌细胞加入凋亡检测试剂后，流式细胞仪显示，在３株胰腺癌细胞中，实验组细胞凋亡率较对照组细胞凋亡率明显增高（Ｐ＜０．０１），差异有统计学意义（见表２）。２．４选取ＳＷ１９９０细胞进行通路蛋白验证蛋白印迹法显示降低ＥＮＡＨ表达后，ｐ－Ｅｒｋ、ｐ－ＡＫＴ和ｐ－ｐ６５通路蛋白表达明显下调，ＩｍａｇｅＪ软件定量分析蛋白表达情况，相对于内参表达量（见表３）。

３讨论

ＥＮＡＨ通过控制肌动蛋白丝网络在细胞运动中起重要作用［６］，如前所述，在多种恶性肿瘤中表达上调。有研究表明在乳腺癌中，ＥＮＡＨ过表达与肿瘤大小，ＴＮＭ分期有关，ＥＮＡＨ在肝细胞肝癌中表达上调，并且其过表达与肿瘤预后明显相关，这说明ＥＮＡＨ可能是ＨＣＣ的潜在预后生物标志物［７，８］。目前胰腺癌的治疗方法有限，且效果不佳。因此寻找胰腺癌新的治疗靶点至关重要。本研究，我们从ｍＲＮＡ水平证明了ＥＮＡＨ在ＳＷ１９９０、ＣＦＰＡＣ－１、ＰＡＮＣ－１胰腺癌细胞株中过表达，平板克隆实验中ｓｉＲＮＡ转染后胰腺癌细胞的增殖较对照组明显下降，检测细胞凋亡率发现转染后的胰腺癌细胞凋亡率较对照组却明显上升。这说明ＥＮＡＨ的表达促进胰腺癌细胞的增殖并抑制胰腺癌细胞的凋亡从而促进细胞生长。目前ＥＮＡＨ已被证明是Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ途径的转录靶点，并且是Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ和Ｎｏｔｃｈ信号级联反应的新纽带［９］。此外，ＥＮＡＨ与Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ途径的可能联系在大肠癌，乳腺癌和肝细胞癌细胞系中也有实验证明［１０］。为了探索ＥＮＡＨ在胰腺癌中促进细胞增殖的分子机制，我们通过ＫＥＧＧ分析得出ＭＡＰＫ、ＡＫＴ通路与ＥＮＡＨ的增殖密切相关，陈迪等人得出ＥＮＡＨ在胃癌中ＥＮＡＨ通过ＭＡＰＫ、ＡＫＴ通路促进胃癌细胞的增殖和转移［１１］。我们通过敲低ＥＮＡＨ表达的ＳＷ１９９０胰腺癌细胞株验证了ＭＡＰＫ、ＡＫＴ通路上相关蛋白的表达，发现了磷酸化的Ｅｒｋ、ＡＫＴ蛋白明显降低，这就说明ＥＮＡＨ在胰腺癌中ＥＮＡＨ通过ＭＡＰＫ、ＡＫＴ通路也可促进胰腺癌细胞的增殖。以上结果表明，ＥＮＡＨ在胰腺癌的增殖中具有重要的调节作用，并通过ＭＡＰＫ、ＡＫＴ通路影响胰腺癌细胞的增殖。此外，我们的研究还发现降低ＥＮＡＨ表达促进了胰腺癌细胞的凋亡，但具体的机制尚有待进一步研究。ＥＮＡＨ有望成为胰腺癌新的生物学标志物，为胰腺癌患者的诊疗提供新的靶点。

作者：杨亚利 容雄飞 朱国松 孟凡民 张加强 单位：河南省人民医院 郑州大学人民医院 麻醉与围手术期医学科

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