【摘要】目的观察下调FAM111B对宫颈癌细胞系C-33A和HeLa增殖、细胞周期和凋亡的影响及其可能机制。方法应用慢病毒载体siRNA-FAM111B及Null，分别感染C-33A和HeLa细胞。实时定量PCR方法（qRT-PCR）和Westernblot方法分别检查各组细胞FAM111B基因与蛋白的表达。应用CCK-8方法检测FAM111B对细胞增殖能力的影响。流式细胞术PI染色细胞周期检测各组细胞周期变化。流式细胞术AnnexinV／PI双染方法检测各组细胞的凋亡情况。Westernblot法检测p53及下游Bax和Bcl-2的表达。结果成功转染C-33A和HeLa细胞，FAM111B基因与蛋白表达水平均下调。转染siR-FAM111B能抑制宫颈癌细胞的增殖，C-33A和HeLa细胞发生G期阻滞。下调FAM111B诱导宫颈癌细胞凋亡，促进p53蛋白表达，进而上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白的表达。1结论下调FAM111B抑制宫颈癌细胞的增殖，促使细胞周期G期阻滞，诱导细胞凋亡，与调节p53蛋白进而激活1下游相关信号通路相关。

【关键词】FAM111B；宫颈癌；增殖；细胞周期；凋亡；p53

宫颈癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，2018年全球范围内新发病例约57万，死亡数约为[1]31.1万人。虽然近年来对于女性人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）感染的早筛检测，使发病率略有下降，但仍是女性恶性肿瘤相关死亡[2]的主要原因之一。目前，在国际妇产科联合会（InternationalFederationofGynaecologyandObstetrics,FIGO）制定的分期基础上，以手术为基础的治疗手段，术后根据肿瘤大小、淋巴结转移、宫旁器官受累等临床变量辅以放疗化疗等支持治疗[3]，并未取得令人满意的疗效，因此当务之急是寻找[4]更有效的治疗靶点。宫颈癌化学药物治疗，目前以顺铂、紫杉醇等药物为主。顺铂主要与DNA结合，引起交叉联结，从而破坏DNA的功能，并抑制细胞有丝分裂，实现细胞周期阻滞。紫杉醇可使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡，从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂和诱导细胞凋亡。可见细胞周期阻滞与凋亡在宫颈癌治疗的重要性。FAM111B（familywithsequencesimilarity111memberB）是FAM111家族的成员，位于人染色体11q12.1上。最初认为它在常染色体显性遗传性纤维性脉络膜病（hereditaryfibrosingpoikiloderma,HFP）[5]发生发展过程中起着关键作用，但其在肿瘤发生发[6]展中的作用研究较少。前期我们通过TCGA网站数据发现，在宫颈癌中FAM111B较癌旁组织高表达，本文探讨FAM111B在宫颈癌中的生物学作用。

1材料与方法

1.1细胞与试剂人宫颈癌C-33A和MCF7细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，MEM培养基和胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）购自Hyclone公司，siR-FAM111B慢病毒载体由上海吉凯公司代为构建，TMSYBRPremixEaqII试剂盒购自TAKARA公司，CCK-8试剂盒和AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自凯基公司，PI细胞周期检测试剂盒购自Sigma公司，Anti-FAM111B单克隆购自Abcam公司，Anti-p53、Anti-Bax和Anti-Bcl-2单克隆抗体购自CellSignalingTechnology公司。1.2细胞培养与转染C-33A和HeLa细胞应用含10%胎牛血清的MEM培养基，在37℃，5%CO条件下进行培养，适时换2液传代。当细胞处于对数生长期时，调整细胞浓度4为1×10/ml，2ml细胞悬液接种于6孔板中，病毒感染复数（multiplicityofinfection,MOI）按10:1进行转染，12h换液，适时观察感染效率。1.3qRT-PCR检测FAM111B基因表达慢病毒转染各组细胞48h后收集各组细胞总RNA，PCR仪反转录RNA为cDNA，SYBRGREEN法进行qRT-PCR反应。反应条件为95℃30s1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃-△△CT30s。结果应用2法计算相对表达量。上游引物：5'-GCCCTTGAAATGCAGAATCCA-3'，下游引物：5'-GCTGTAAACACACTACGGTCTAA-3'。1.4Westernblot法检测蛋白表达慢病毒转染各组细胞48h后，应用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，以每孔20μg的总蛋白量计算并配置样品，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳。湿转法转膜至PVDF膜上，5%BSA室温封闭2h。按各抗体说明书稀释抗体，4℃孵育过夜。洗涤，对应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体37℃室温孵育1h。TBST洗涤，采用ECL化学发光法，于凝胶成像系统中曝光。1.5CCK-8法检测细胞增殖能力5调整各组细胞浓度为1×10/ml，96孔板每孔加入100μl细胞悬液，每组设5个复孔，按上述培养条件培养。于24、48、72h各时间点加入10μlCCK-8，37℃继续培养3h后，450nm波长处应用酶标仪检测光密度值（OD）。1.6流式细胞术检测细胞周期收集各组细胞，预冷的PBS洗涤细胞，75%乙醇4℃固定24h，PBS洗涤收集细胞，碘化丙啶（PI）染色，在缓冲体系中加入RNase，37℃避光孵育30min，流式细胞仪检测。1.7流式细胞术检测细胞凋亡6不含EDTA胰酶消化收集各组细胞1×10个，预冷PBS洗涤，细胞重悬于100μlBuffer中，设空白对照组与单染组，实验组分别加入5μlAnnexinV-FITC避光室温孵育15min，加入PI染料5μl，加入400μlBuffer，吹打细胞至单细胞悬液，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。1.8统计分析所有数据用SPSS21.0软件进行统计分析，所得结果用x±s表示，三组两两比较采用单因素方差分析（ANOVA）检验，两组实验采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1慢病毒载体下调宫颈癌细胞FAM111B表达设置对照组（CON），GV248载体感染组（NC）和siR-FAM111B感染组（siR-FAM111B）。qRT-PCR和Westernblot结果显示，siR-FAM111B感染C-33A和HeLa细胞后与CON组和NC组相比，FAM111B基因和蛋白水平皆明显下调（图1A、1B，P＜0.05）。2.2下调FAM111B表达抑制宫颈癌细胞增殖CCK-8法检测下调FAM111B对C-33A与HeLa细胞增殖的影响，分别于24、48和72h检测细胞的OD值。siR-FAM111B组与NC组相比增殖能力受到明显抑制，48h与72hOD值有统计学差异（图2，P＜0.05）。2.3下调FAM111B表达影响宫颈癌细胞周期流式细胞术PI染色检测细胞周期变化，与NC组相比下调FAM111B表达使细胞周期阻滞在G/G期，01C-33A细胞NC组G/G、S、G/M期比例分别为012（34.37±1.87、24.55±1.53、41.34±2.34）%，siR-FAM111B组分别为（61.16±2.64、15.44±1.32、23.39±1.42）%。HeLa细胞NC组G/G、S、G/M期012比例分别为（30.3±1.54、26.70±1.12、43.00±1.66）%，siR-FAM111B组分别为（59.91±2.04、13.96±1.07、26.13±1.46）%。在两种细胞系中都观察到G/G期比例增加，S与G/M期比例减少012（图3）。2.4下调FAM111B表达诱导宫颈癌细胞凋亡应用流式细胞术检测宫颈癌细胞凋亡，图4A中+-+Annexin-VPI亚群表示细胞早期凋亡，Annexin-V+PI表示细胞晚期凋亡，细胞凋亡率由早期凋亡与晚期凋亡之和表示。C-33A细胞NC组凋亡率为(5.12±0.84)%，siR-FAM111B组的凋亡率为(26.53±3.15)%，HeLa细胞NC组凋亡率为(2.47±0.63)%，siR-FAM111B组的凋亡率为(28.17±3.86)%，两组细胞中siR-FAM111B组细胞凋亡较NC组相比明显增加，差异有统计学意义（P<0.05，图4B）。下调FAM111B表达诱导C-33A和HeLa细胞凋亡。2.5Westernblot检测p53、Bax和Bcl-2的表达Westernblot法检测FAM111B干扰前后C-33A与HeLa细胞p53、Bax和Bcl-2蛋白表达变化。如图5所示，下调FAM111B表达在C-33A与HeLa细胞都观察到p53蛋白显著增加，进一步观察到Bax表达增加，Bcl-2表达减少。

3讨论

FAM111B又名CANP和POIKTMP，位于人染色体11q12.1，蛋白C端有胰蛋白酶样半胱氨酸/丝氨酸[5]肽酶结构域。Mercier等通过全基因组测序发现FAM111B基因突变与HFP发病有关，并确定了3个错义突变位置。但对FAM111B基因的功能研究较少，[7]尤其在肿瘤领域。近来，Akamatsu等的研究发现，FAM111A-FAM111B突变作为3个主要的突变基因之一可以引起日本男性前列腺癌的发病。在胰腺癌中也观察到FAM111B突变可能与胰腺癌的发生关系紧[6]密。在宫颈癌中，FAM111B高表达与宫颈癌的远处[8]转移和预后有关。本研究中通过siRNA慢病毒载体干扰宫颈癌C-33A和HeLa细胞FAM111B的表达，并应用qRT-PCR法和Westernblot法验证FAM111B的基因和蛋白表达均下调。CCK8法检测FAM111B对宫颈癌细胞增殖的影响，结果显示下调FAM111B的表达能够抑制C-33A和HeLa细胞增殖。之前有研究表明，p53与[9]FAM111B直接相互作用发挥作用，p53作为重要的抑癌基因与细胞周期，细胞凋亡等多种生物学行为[10,11]有关。本研究通过流式细胞术检测下调FAM111B对C-33A和HeLa细胞周期与细胞凋亡的影响，结果显示两组细胞下调FAM111B使G/G期细胞比例增01加，使细胞周期阻滞于G/G期。细胞凋亡结果显01示，下调FAM111B诱导C-33A和HeLa细胞凋亡。为进一步探讨FAM111B诱导凋亡的可能机制，WB法检测p53蛋白的表达，观察到抑制FAM111B的表达促进p53的表达。线粒体凋亡通路作为p53信号通路下游[12]的重要级联通路。为探讨FAM111B是否通过线粒体凋亡通路诱导宫颈癌细胞凋亡，应用WB检测Bax和Bcl-2的表达，结果显示，下调FAM111B促进Bax表达，抑制Bcl-2表达。Bax和Bcl-2作为BCL家族的重要成员，在凋亡调控中起着关键作用，其中[13]Bax作为促凋亡蛋白，Bcl-2为抑凋亡蛋白。在肺腺癌中也观察到下调FAM111B表达抑制BAG3和Bcl-[14]2的表达。

作者：秦永超 崔丹丹 李昕凌 吴晓竹 张韵琢 陈海英 张莉 单位：沈阳市妇幼保健院产科病房 中国医科大学附属第一医院产科病房

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